Tophat介紹與語法

介紹

Tophat是一款可以用來拼基因序列的生資工具，其最重要的特色就是其演算法對於mRNA的splicing junction有比較好的辨識能力。

由約翰霍普金斯大學的Daehwan Kim 和 Steven Salzberg （ Center for Computational Biology）以及 華盛頓大學的Cole Trapnell 教授（ Genome Sciences Department ）.  在約翰霍普金斯大學有這款工具的詳細指南, 這工具主要是在linux下的command line執行。

原理

這邊介紹此工具在比對時的原理，可以幫助思考在設計流程的細節，以下是圖解：

基本運作原理：

• 第一步:Optimal transcriptome alignment
• 第二步Genome alignment
• 第三步:Spliced alignment

在Paired-end的RNAseq裡面:

• 假如有Annotation的話，其會先利用bowtie2 genome index 由gtf/gff file組成transcript sequences，先將Reads針對其來ALIGNMENTS
• 當reads對不到Transcripts時，其會跟genome mapping
• 此時會將ummaped reads分成小片段在去對genome mapping，此時其會根據我們設定的最大intron size來跑分析，此時tophat會同時尋找indel或是fusion break point
• 基因序列在可能splicing site的地方會被index且concatenate，此時沒有mapped到哦會被放在junction flanking index
• Segment alignments 被stitch起來行成完整的alignment
• 當multiple alignment發生時，tophat會計算其分別的alignment score

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