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文獻閱讀：RNAseq在臨床應用的可能和挑戰(下)

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原始論文：Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., & Craig, D. W. (2016). Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nature Reviews Genetics, 17(5), 257–271. doi:10.1038/nrg.2016.10

 

論文的最後，談到這些新科技如何整合進臨床之中

第一個重點就是“新的檢測（這邊指得當然就是RNAseq）”，要能變成現行臨床工作的一部份，需要符合許多特性，可以由三個層面一步步來看，分別是Analytical validity (檢測本身的效力)、Clinical validity（臨床上的檢測能力）、Clinical utility（對於最終的臨床決策的貢獻度）。

第一步：Analytical validity

相對於實驗室裡的檢測，處理的檢體都是在control condition下，所以要能讓每一次的實驗都能reproducible的技術門檻就比較低，對比於臨床簡體的複雜性，還要能在此狀況下維持檢驗的穩定性、感測極限等等，就是第一關的重要門檻，要能在有良好的檢測標準來提供檢測sensitivity、specificity的驗證，再來是每次重複的結果應該要相似的（reproducibility），不會因為微小的變數造成數值的大波動。（robustness），如前exosome的研究便是因為其容易波動而造成無法定量。

以RNAseq來看，撇開前製定序所花的不算，光後端的分析方式、參數的差異，就會造成結果有所不同，在2013年，Genetic European Variant in Disease consortium為了解決這問題設計了一組實驗來處理這些technical reproducibility和feasible的問題，收集了465個人的lymphoblastoid cell，在七個定序中心分別執行，最後總結了一些在後端上可以用來驗證定序結果的，像是GC content、fragment size、transcript length、percentage of reads mapped to annotated exon (這部分可以參考所謂的annotation QC)。除此之外，由FDA領頭的SEQC study和ABRF study也有大量研究為了解決和提出相關標準。

Su, Z. et al. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nat. Biotechnol. 32, 903–914 (2014).

Li, S. et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the ABRF next-generation sequencing study. Nat. Biotechnol. 32, 915–925 (2014).

 

第二步: Clinical validity

當檢測技術能在臨床檢體上保持者可重複性時，接下來檢測就要達成可以實際區分biological difference的區別力。

第三步: Clinical utility

當前兩部都達成後，再來要看這個檢驗的結果能如何改變治療，如同companion diagnostic等等，通常此時就需要setup 臨床的試驗，來看實際在臨床場域中的效果！

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除此之外，FDA也有針對RNAseq為主的檢測項目做出一些法規的架構，可以由此深入看美國FDA對於NGS技術延生的檢測所抱持的想法

US Department of Health & Human Services. Center for Devices and Radiological Health. FDA notification and medical device reporting for laboratory developed tests (LDTs) — draft guidance. [online]  (2014).

US Department of Health & Human Services. Center for Devices and Radiological Health. Framework for regulatory oversight of laboratory developed tests (LDTs) — draft guidance. [online]  (2014)

US Department of Health & Human Services. Optimizing FDA’ s regulatory oversight of next generation sequencing diagnostic tests — preliminary discussion paper. [online]  (2014).

Evans, B. J., Burke, W. & Jarvik, G. P. The FDA and genomic tests—getting regulation right. N. Engl. J. Med. 372, 2258–2264 (2015).

 

文獻閱讀：RNAseq在臨床應用的可能和挑戰(上)

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原始論文：Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., & Craig, D. W. (2016). Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nature Reviews Genetics, 17(5), 257–271. doi:10.1038/nrg.2016.10

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這篇文章Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges,鉅細彌遺地把RNAsequencing的應用與相關的疾病相連結，並且闡述其在臨床上的潛力，其主要分三大部分來談論RNAseq，第一部分先講利用RNAseq可以探討用來看哪些東西（轉錄變異transcript variant、non-codingRNA等），第二部份則是針對RNAseq在感染疾病的診斷和追蹤的應用，第三部份則是談論將RNAseq技術實際整合進目前的臨床情境中可能面臨的validation和法規問題。

 第一部分介紹從RNAseq可以用來看各式aberrant transcription

  • mRNA expression profile是最基本用RNAsequencing想看的，而其在臨床上實際的應用相對於DNAsequencing 可以有更多的空間，因為其可以看到動態的基因表現狀況，可用來監測、診斷疾病的狀態，如OncotypeDx 21-gene expression assay，其可以用在乳癌病患之基因檢測，用來預測癌細胞切除手術後復發的機率，或是化療及放射線治療的反應、AlloMap則是用來看心臟移植病患的急性細胞排斥，這項基因檢測服務非常完整，其臨床試驗結果還發表在NEJM上，主要使用11個基因作為signature來預測風險，收受檢體後2-3個工作天就有報告，除此之外，其他基因檢測如免疫系統的監測Adaptive Biotechnology，其主要看T-cell receptor的變異，不過也自己研發用來分析RNAseq的分析工具immunoSEQ。（雖然上述公司所發展的基因檢測商品並非直接使用RNAseq）
  • gene fusion所造成的transcripts異常，可用來區分癌細胞的subtype，不過最常見得還是在血液疾病，其中急性骨髓白血病（AML）最具有代表性，其在t(8;21)(q22;q22) translocation造成的AML1-ETO嵌合，在攝護腺癌細胞中也發現有TMPRSS2-ERG的嵌合現象，跟疾病預後相關。
  • alternative transcripts（由splicing或是structural variant造成）在發育疾病、神經退化疾病或是癌症中有角色存在，如AR-V7在頑固型攝護腺癌、EGFRvIII在glioblastoma、乳癌的BRCA1/BRCA2。
  • 特殊的RNA種類隨者技術的改善和推陳出新，開始有人研究nc-RNA或是extracelluar RNA在疾病中可用來診斷的機會。
    • extracellular RNA 是在biofluid中的胞外RNA，其被體內細胞分泌出後由extracellular vesicles 或是RNA-binding protein及lipoprotein。去量測exRNA的好處是其可以由血液中獲取（及最近很火俗稱的blood biopsy），但其lack of tissue specificity是目前的問題所在，因為所有的細胞都可能分泌出exRNA，而目前有科學家使用抽取特定組織間液的方式來解決這問題。而exRNA可以用來檢測或是追蹤癌症進展，ExoDx Lung 是今天2016年一月發表的商業基因檢測商品，其可以由血液檢體中檢測肺癌病人是否有EML4-ALK fusion transcripts或是T790M。

第二部分則介紹將RNAseq使用在感染疾病的追蹤、診斷上，如RNA-virus相關的疾病登革熱、A肝、D肝、SARS等等，在感染疾病的追蹤上則可以利用RNAseq來做metagenomic的應用，看是哪種type的感染或是其可能的傳播路徑。

第三部份則是介紹實際將RNAseq導入臨床應用，撇開本身實驗及分析RNAseq結果的困難度外，最重要的是相關法規，如執行RNAseq的醫院實驗室要怎麼管理和通過驗證，都算有其難度。

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