在之前有討論過RNAseq的分析中，基因表現的分析有很多不同的策略，一種採用定序片段（reads）對應到基因區域的數量代表基因表現（counting reads per genes），另一種則是使用RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads) ，兩種方式都有相對應針對資料正規化（normalization）的想法，可以參考這篇。

HTSeq 是用來處理alignment好的bam檔，將其產生counting reads table。而之後便可以把這資料丟到DESeq做基因表現分析（gene expression analysis），DESeq是R語言的package，可以用來做基因表現分析，其中用的原理便是採用counting reads per genes來做分析。

首先，HTSeq是一款python的軟體，除了計算reads count per genes 也可以用來處理基本的bam file writing 或是genomic interval的處理，其必須搭配安裝python 的一些週邊package，如PyPI、pysam，在MacOS X 上則先安裝xcode、MacPort(套件管理程式，用來安裝SciPy的套件)，另外要注意其支援的為python2.7版本。

在使用htseq-count時最重要的是他用三種mode，關於他如何定義reads對到genes的關係，一般defaut為union。官網說明連結

使用counting reads功能的簡單語法如下：

基本上，輸入的bam檔必須經過sorting，最好是by reads names的sort setting，可以節省記憶體的要求，另外，annotation上，使用ensembl的annotation其gene ID和transcripts ID有區別性，對於程式來說比較好。

輸出會呈現如下：