reference:
Trapnell, C., Williams, B. a, Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., van Baren, M. J., … Pachter, L. (2010).,Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology, 28(5), 511–515. http://doi.org/10.1038/nbt.1621

cufflinks是一款用c++撰寫的程式，可以用來處理RNAseq已經align玩的資料，將其alignmenta組合成transcipts，並且找尋不同isoforms的可能，操作上在command line下使用。可以在這邊的網站下載以及使用說明書。

原理

第一步：在paired-end的設計下，其會把一對的reads一起看，將其排列成overlapped的bundles，程式會先找出incompatible的fragment，因為這些特別的點代表者一種spliced isoforms的可能，如下圖所示，黃色藍色和紅色分別都是被標示的incompatible fragments，整個資訊會用node和edge的方式串接起來

第二步，會使用這種graph產生出isoforms的可能組合

軟體使用的注意事項：

1. 假如是paired-end reads實驗設計，要把reads identified的數值要改成一樣的。
2. samtools必須安裝好，且路徑設計在PATH變數下

語法：

連結

–overlap–radius:default 50 base-pair
 這是用來找出比較長距離的gene models

-g  reference.gtf
可以給定已知的gene model reference

 

輸出：

總共會輸出四個檔案：transcripts.gtf   isoforms.fpkm_tracking genes.fpkm_tracking

小建議：

假如要有多組sample要做cufflinks的話，建議先把bam檔合成單一個檔案，因為當alignment數越多，使用其演算法能找出的獨特isoforms較多！