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原始論文：

Cole Trapnell,Adam Roberts,Loyal Goff,Geo Pertea,Daehwan Kim,David R Kelley,Harold Pimentel,Steven L Salzberg,John L Rinn& Lior Pachter. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.Nature Protocols.7,562–578(2012)Doi:10.1038/nprot.2012.016

RNAseq的資料分析主要有兩個大目的：

• 找尋新的基因或是transcripts
• 比較不同狀態下的基因表現亮

而在分析步驟上，可以把它拆成三個分析流程：

• read alignment
• transcript assembly 或是 genome annotation
• transcript and gene quantification

本篇論文主要介紹用期開發的程式作為workflow，並且簡單介紹每個tool之間的異同。

所使用的工具和工作流程：

Read alignment with Tophat
Reads拼回去reference的步驟非常重要，他可以找出所有可能的insertion/deletion/indel，這些資訊可以讓我們了解辨識出相對於對照序列的polymorphism，另外，對不回去的reads，可能是新的protein-coding genes或是noncoding RNA。這邊拼回去的結果，也會影響之後如何去計算transcript abundance的數值。

Transcripts assembly with Cufflinks
為了要知道各種基因的表現量，我們必須知道各種reads所對應的isoforms transcripts，這邊就必須把Reads拼組成各種特定的transcipts，這步驟牽涉到如何辨別不同種transcripts variant ，所以最後產生transfrags來表達所有可能。

cufflinks會將一些low abundance的tansfrag當作是來自於immature transcripts而丟棄，這部分是要了解的。（或許這步驟可以思考一下！），有時候我們會將所有的bam pool在一起讓他找transcripts，但這種作法其實一方面增加電腦計算的loading，另一方面，則是會讓程式在計算isoform時增加很多變數，所以cuffmerge應映兒生，他可以把individual產出的transfrag merge在一起看！

Differeial Expression Analysis with Cuffdiff

cuffdiff可以輸出好幾個檔案描述不同基因和transcripts的表現量差別和p value以及其名字和在基因體上的位置，另外，cuffdiff也可以把同一組基因裡面不同TSS的transcripts分組去計算他們之間比例的變化！

視覺化資料CummeRbound

cuffdiff提供基因和transcripts的表現量分析，且這些資料是以tab-delimited的方式輸出很方便後續的分析，而CummeRbound則是提供一個更容易操作的視覺化分析，可以將cuffdiff的計算結果做更細緻的分析。

替代工具：

• Read-alignment 
  • GSNAP
  • START
  • Map-Splice
• Transcriptome reconstruction
  • De novo transcripts assembly
    • Trinity
    • Trans-Abyss
    • Oases
• Quantification
• Differential expression

有趣的相關論文：

Read-alignment

• Wu, T.D. & Nacu, S. Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads. Bioinformatics 26, 873–881 (2010).
• Wang, K. et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Res. 38, e178 (2010).
• Au, K.F., Jiang, H., Lin, L., Xing, Y. & Wong, W.H. Detection of splice junctions from paired-end RNA-seq data by SpliceMap. Nucleic Acids Res. 38, 4570–4578 (2010).

Transcript reconstruction

• Guttman, M. et al. Ab initio reconstruction of cell type-specific transcriptomes in mouse reveals the conserved multi-exonic structure of lincRNAs. Nat. Biotechnol. 28, 503–510(2010).
• Griffith, M. et al. Alternative expression analysis by RNA sequencing. Nat. Methods 7,843–847 (2010).

Quantification

• Li, B., Ruotti, V., Stewart, R.M., Thomson, J.A. & Dewey, C.N. RNA-seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Bioinformatics 26, 493–500 (2010).
• Katz, Y., Wang, E.T., Airoldi, E.M. & Burge, C.B. Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation. Nat. Methods 7, 1009–1015 (2010).
• Nicolae, M., Mangul, S., Măndoiu, I.I. & Zelikovsky, A. Estimation of alternative splicing isoform frequencies from RNA-seq data. Algorithms Mol. Biol. 6, 9 (2011).

Differential Expression

• Anders, S. & Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11, R106 (2010).
• Robinson, M.D., McCarthy, D.J. & Smyth, G.K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.
• Bioinformatics 26, 139–140(2009).Wang, L., Feng, Z., Wang, X., Wang, X. & Zhang, X. DEGseq: an R package for identifying differentially expressed genes from RNA-seq data. Bioinformatics 26, 136–138 (2010).