RNAseq: Reads counting

Han Y, Gao S, Muegge K, Zhang W, Zhou B. (2015) Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights 9(Suppl 1):29-46. [article]

在RNAseq資料裡面,常使用對應到某個基因序列的reads量來代表其基因表達量,當然要直接把reads數量對應成基因表現量,這邊一定要仔細考慮在定序前檢體處理的步驟都有相關,比如是否是strand-specific,這些都要列入考慮的因素!

這邊有一些工具可以計算reads counting的量,如Bedtools,給定其GFF和bam檔,其可以在特定的區段計算出counts,其內建是會計算兩個strands上有興趣區域的reads一起計算,但這能調整。

另一款工具HTseq則是有把strands-specific概念在預設計算中,其只會把reads對應到特定的strands上。


在R語言裡,easyRNAseq使用上簡易上手、summarizeOverlap為GenomicRanges裡頭的韓式、featureCount (Rsubread)裡頭則採用了非常有效率的chromosome hashing和feature blocking 的方式。

除了使用工具不同,計算出來的count值也會不同,所使用的gene model 同樣影響到後續的計算,尤其是在跨過junction的reads上,有論文發現在使用RefGene、Ensembl、UCSC三種版本對照序列,發現其中21958個常見基因只有16.3%的基因其算出的count相同,其中9.3%基因有大於50%的差異。

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