常見的Alignment Genomic Data Archive Format

alignment後的基因定序資料通常是任何分析的起頭，如廚師把配菜弄好擺在流理台後，要大顯身手，此時一個好的工具來處理就是非常重要，不然會有種看者滿山資料卻不知從何下手。alignment後的定序資料通常就是已有配對到reference genome上的reads，目前此類檔案有三種format: SAM, BAM, CRAM，檔案大小依序也是從左到右，而SAM(Sequence Alignment/Map)和BAM(Binary Alignment/Map)兩個檔案基本上是同樣的內容，差別在SAM是人看得懂的，BAM是壓縮成binary的，前兩種檔案格式出現的時候，定序資料量還沒現在這麼大，最近連BAM格式還是被嫌太大，CRAM format是會逐漸取代前者的壓縮方式，EMBL已經改用CRAM的格式來儲存定序檔案了，其概念是所謂的reference 壓縮的模式，如下圖所事是：

簡單來說，就是以reference上相對位置和改變的資訊來儲存，而非直接儲存reads序列，
整個降低檔案儲存需要的大小。使用cram格式相對於bam可以節省約10-30%的檔案大小，但因為cram的格式是基於reference來減低檔案格式，需要固定的reference版本，才不會再還原時候有問題，所以每個CRAM檔案會有MD5 checksum，來確保記錄所使用的reference版本。

關於CRAM的相關reference:

Hsi-Yang Fritz, et al. (2011). Genome Res. 21:734-740

Cochrane G. et al. (2012). GigaScience 1:2

SAM Format的形式

SAM的檔案架構分兩部分，一部分是Header，另一部分是Alignment。外觀如下圖：

Header的部分位在整個檔案的一開頭，裡面會有這份檔案的基本資料，如有無sorted過、裡頭使用的reference及其長度、使用過什麼工具處理和alignment時所下的指令。Header裡頭會有幾個關鍵組成：＠SQ/ @RG/ @PG，分別代表以下的意義

＠SQ 這個開頭含有做alignment所使用的reference序列資訊，SN代表的是sequence name，而緊跟者為LN，代表此參考序列的長度

@RG代表者read group的資訊和sample的基本資料，部分軟體會根據裡頭的ID，去辨識有無batch effect，有的會有PL指標去代表其所使用的定序平台

@PG裡頭含有此次alignment所使用的程式資訊，CL指標後面有所下的指令，VL後面有使用的軟體版本資訊

Alignment的部分就是實際一個個read的alignment資料，一行為一個reads，其用以下的資訊來說明每個reads的狀況：

依序是每個Reads獨一無二的編號，通常還有在定序機器上的位置，FLAG，則是代表此reads的mapping狀態，chr則很明顯的是對到的染色體，Start代表reads對應到reference上的開始位置，CIGAR則代表這個reads每一個位置跟reference mapping的狀態，是否100Match到，後面還有一些進階資訊，假如是paired-read則會顯示他的mate reads的位置。

因為sam檔沒有壓縮過，所以大多數會以bam檔形式儲存，必須使用samtools來轉換，以便閱讀上面那些資訊，這邊samtools在處理bam/sam檔案上就非常重要了！

可參考這篇介紹samtools的使用！